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  Article

  
  

  • Libre accès
  • Publication : 2 avril 2020

  
  

  Calcification dystrophique et ossification hétérotopique dans les tissus fibrocartilagineux de la colonne vertébrale dans l’hyperostose squelettique idiopathique diffuse (DISH)

  
  

  • Dale E. Fournier,
  • Patti K. Kiser,
  • Ryan J. Plage,
  • S. Jeffrey Dixon &

  
  

  • Cheryle A. Séguin

  
  

  Bone Research volume  8, Numéro d’article: 16 (2020)  Citez cet article

  
  

  
  

  
  

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  Résumé 

  
  

  
  

  L’hyperostose squelettique idiopathique diffuse (DISH) est une spondylarthropathie non inflammatoire répandue caractérisée par une formation minérale ectopique le long de l’aspect antérolatéral de la colonne vertébrale, mais on sait peu de choses sur sa pathogenèse sous-jacente. Notre objectif était d’évaluer les caractéristiques histopathologiques et la composition du minéral ectopique dans les tissus rachidiens affectés par dish chez l’homme. Lessegments de la colonne vertébrale thoracique de six donneurs cadavériques embaumés (une femme et cinq hommes; âge médian de 82 ans) répondant aux critères de diagnostic radiographique de DISH ont été évalués à l’aide d’analyses radiologiques, histologiques et physiques. Dans l’ensemble, les effets histologiquesde la minéralisation ectopique sur des segments de mouvement individuels étaient hétérogènes, y compris des régions d’ossification hétérotopique et de calcification dystrophique. Hétérotopique

  
  

  les ossifications étaient caractérisées par des os tissés et lamellaires,des zones ifocales mult de cartilage métaplastique et des ponts osseux le long de l’aspect antérieur de l’espace du disque intervertébral. Les calcifications dystrophiques ont été caractérisées par un aspect amorphe, une teneur élevée en calcium et en phosphore, une diffraction des rayons Xcorrespondant à celle de l’hydroxyapatite et des radiodensités supérieures à celles de l’os cortical. Des calcifications dystrophiques ont été trouvées dans les segments du ligament longitudinal antérieur et de l’anneau fibreux en mouvement, qui rencontrent et ne respectent pas les critères radiographiquespour DISH. En résumé, nos résultats indiquent que dans DISH, des minéraux ectopiques se forment le long de l’aspect antérieur de la colonne vertébrale par ossification hétérotopique et calcification dystrophique des tissus fibrocartilagineux. Bien que les deux types de minéralisation ectopiquesoient capturés par les critères radiographiques actuels de DISH, la calcification dystrophique peut refléter un processus pathologique distinct ou un stade précoce de la pathogenèse de DISH.

  
  

  Introduction

  
  

  
  

  
  

  
  

  L’hyperostose squelettique idiopathique diffuse (DISH) est une spondylarthropathie non inflammatoire caractérisée par des discroissances osseuses ou hyperostoses le long de l’aspect antérolatéral de la colonne vertébrale, en particulier dans la région thoracique. 1  DISH est diagnostiqué par la détection radiographique de la formation minérale qui coule le long de quatre corps vertébraux contigus, la préservation de la hauteur du disque intervertébral (DIV) dans les zones concernées et l’absence d’ankylose osseuse de la facette vertébrale desarticulations nd/ou sacro-iliaques. 2  Bien qu’il ne soit pas inclus dans les critères diagnostiques, le DISH est souvent associé à la présence d’hyperostoses extraspinales, généralement dans les articulations du genou, de l’ankle, de la hanche, del’épaule et du coude. 3  Les symptômes associés à la DISH sont variables, allant de la raideur de la colonne vertébrale et de la diminution de l’amplitude des mouvements de la colonne vertébrale (avec ou sans maux dedos) à, dans les cas graves, à la dysphagie, à la compression de la moelle épinière / racine nerveuse et à la fracture vertébrale. 4,5,6  Notamment, les symptômes cliniques sont mal compris et le diagnostic radiographique de DISH est limité à un état pathologique avancé. 7

  
  

  
  

  
  

  La prévalence de la DISH en Amérique du Nord et en Europe est estimée à 15% – 25% et 17% de la population de plus de 50 ans, respectivement. 8,9  Les facteurs de risque de DISH comprennent l’origine ethnique (par exemple, les Caucasiens),8 le sexe

  
  

  (hommes > femmes),8,9  ans avancés,8,10  et troubles métaboliques (p. ex. obésité, diabète sucré). 11  Ensemble, l’absence de détection précoce de la DISH, l’augmentation des facteurs de risque potentiels et la méconnaissance de la DISH chez les professionnels de la santé suggèrent que sa prévalence est plus élevée que celle précédemment rapportée.

  
  

  
  

  La cause et les voies biologiques contrôlant la formation de minéraux ectopiques dans DISH sont inconnues. Les changements métaboliques systémiques liés à l’obésité, au diabète sucré, au tour de taille important, à l’hypertension, à l’hyperinsulinémie, à la dyslipidémie et à l’hyperuricémie sont associés àDISH. 4,11,12,13,14 Cas familiaux de DISH,15,16 bien que rares, associés à la caractérisation de la minéralisation ectopique de la colonne vertébrale dans des modèles animaux,17,18,19,20  suggèrent l’apport de facteurs génétiques dans  l’étiologie de DISH. Un trouble apparenté, l’ossification du ligament longitudinal postérieur, a été fréquemment rapporté avec DISH et est supposé partager une pathogenèse similaire. 21  Dish est caractérisé par le côté droit de la formation minérale dans la colonne thoracique, qui serait une conséquence de la pression mécanique créée par des pulsations aortiques persistantes sur la gauche servant à inhiber les tissus mous  

  
  

  minéralisation. 22  En fin de compte, notre compréhension limitée de la pathobiologie de la DISH a entraîné l’absence d’indicateurs diagnostiques précoces, de facteurs pronostiques et de  traitements modificateurs de la maladie. 23

  
  

  
  

  La caractéristique DISH de la minéralisation ectopique de la colonne vertébrale est basée sur une description radiographique. 2  Les caractéristiques histopathologiques de DISH sont moins connues. Les rapports initiaux décrivaient les caractéristiques histopathologiques de l’ossification endochondrale du ligament longitudinal antérieur24 ainsi  que les changements dans les caractéristiques générales du DIV. 21,25  En revanche, des études récentes dans les tissus cadavériques ont démontré que le ligament longitudinal antérieur était morphologiquement normal en apparence et était déplacé par un minéral ectopique, mais ne subissait pas lui-même de minéralisation aberrante.   26  Pris ensemble, ces résultats soulignent la nécessité d’identifier et de caractériser la composition du minéral ectopique formé dans dish, ainsi que les types de TISS affectéset les changements cellulaires associés. La présente étude a examiné ces questions en combinant des analyses radiologiques, histologiques et physiques des segments de la colonne vertébrale humaine affectés par DISH.

  Résultats

  
  

  
  

  
  

  
  

  Une étude précédente de notre groupe a caractérisé la morphométrie et la radiodensité du minéral ectopique associé à DISH dans les épines humaines cadavériques embaumées en utilisant l’imagerie par microtraitement (μCT). 27  Les formations minérales aux segments de mouvement individuels de la colonne thoracique ont été différenciées en fonction de la morphologie, classées comme des bandes verticales lorsque l’angle de pontage résultant par rapport aux vertèbres était supérieur à 90°, comme des discroissances horizontales lorsque  l’angle de pont résultant était <90°, ou comme discontinues-inégales lorsque le minéral formait un pont incomplet. 27  Pour la présente étude, nous avons effectué des analyses détailléesde15 segments de mouvement individuels de la colonne thoracique de six donneurs atteints de DISH de l’étude précédente (une femme et cinq hommes; âge médian de 82 ans, intervalle de 72 à 87 ans)

  
  

  (Fig. 1) . 27  Ces épines ont été sélectionnées en fonction (i) du fait qu’elles répondaient aux critères diagnostiques de la DISH (avec au moins quatre segments contigus affectés,2  précédemment évalués par deux observateurs cliniciens) et (ii) chaque colonne vertébrale contenant au moins deux des trois présentations morphologiques de minéralisation ectopique décrites dans notre étude précédente (atchy discontinue,verticale ouhorizontale). 27

  
  

  
  

  Fig. 1

  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  Rendus isosurfaces tridimensionnels (vue antérieure) dérivés de la tomographie microcalculée (μCT) montrant des tissus minéralisés (>310 unités de Hounsfield) des épines incluses dans l’étude. un  homme de 85 ans, vertèbres thoraciques 4-11. b  Mâle de 77 ans, vertèbresoraciques 3–7. c  Mâle de 88 ans, vertèbres thoraciques 7–9. d  Homme de 72 ans, vertèbres thoraciques 3–

  
  

  1. e Mâle de 78 ans, vertèbres thoraciques 4–6. f  Femelle de 86 ans, vertèbres thoraciques  4–7. Les flèches indiquent le niveau du disque intervertébral dessegments demouvement spécifiques inclus dans l’étude; flèches jaunes - présentation inégale continue, flèches orange - présentation verticale et flèches cyan - présentation horizontale. La barre d’échelle représente 10 mm

  
  

  
  

  
  

  
  

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  Caractéristiques histologiques des tissus rachidiens

  
  

  Douze régions de la colonne vertébrale contenant des structures minérales ectopiques à des segments de mouvement individuels ont été isolées (Fig. supplémentaire S1) pour évaluer l’apparence histologique des  tissus affectés. La figure  2  est représentative d’un segment de mouvement avec les caractéristiques morphologiques de « horizontal » et

  
  

  minéralisation « discontinue-inégale »; Fig. 3  est représentatif d’un segment de mouvement avec les caractéristiques morphologiques de la minéralisation « horizontale »; et Fig. 4  est représentatif d’un segment de mouvement présentant les caractéristiques morphologiques de la minéralisation « verticale ». À titre de référence, Fig. supplémentaire. S2  est représentatif  d’un segment de mouvement sans preuve de minéralisations ectopiques provenant d’une colonne vertébrale qui ne répondait pas aux critères diagnostiques de dish. Dans Figs. 2–4,les  radiographies numériques sont associées à des vues à faible grossissement du segment de mouvement intact pour corréler les caractéristiques histologiques avec les zones de minéralisation tissulaire dans les sections de tissus décalcifiés. Des zones  d’intérêt spécifiques sont présentées à un grossissement plus élevé, avec des sections en série colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour localiser les cellules et évaluer la structure de la matrice extracellulaire, le trichrome de Masson pour détecter la composante collagène de la matrice extracellulaire, unplus tardvisualisé par microscopie à lumière polarisée pour évaluer la biréfringence comme indicateur de l’isotropie optique.

  
  

  
  

  Fig. 2

  
  

  

  
  

  
  

  Aspect histologique d’un segment de mouvement représentatif avec présentation horizontale de la minéralisation ectopique associée à DISH. Les images correspondent à l’échantillon représenté à la Fig. 1b,  T6-7. une  radiographie numérique du tissu intact avant la décalcification montrant la localisation du minéral ectopique dans le segment de mouvement (profilé par une ligne jaune pointillée). OS VERTÉBRAL VB, disque intervertébral DIV. b  Sectio représentatifn coloré avec del’hématoxyline et de l’éosine démontrant l’apparence de la section intacte; la barre d’échelle représente 10 mm. La boîte jaune correspond à une région antérieure avec des caractéristiques d’ossification hétérotopique imagée avec un objectif de 10× (c–e), tandis que la boîtewhite correspond à une région de transition de l’ossification hétérotopique au fibrocartilage sous-jacent annulus fibrosus imagé avec un

  
  

  20× objectif (f–h). c,  f coloré avec de l’hématoxyline et de l’éosine; d,  g  taché avec le trichrome de Masson; e,  h les sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine montrées en  c  et  f  visualisées avec une lumière polarisée. Les barres d’échelle pour  c–h  représentent 100 μm. c–e Mettre en évidence les caractéristiques de l’ossification hétérotopique le long de l’aspect antérieur du segment de mouvement, y compris la cavité compartimentée de la moelle osseuse (astérisque noir) et l’os lamellaire organisé (pointes de flèche noires). f–

  
  

  h Caractéristiques de l’os tissé primaire (flèches black) et des nids organisés de  chondrocytes (astérisque blanc) associés à l’ossification endochondrale. Toutes les images sont orientées comme indiqué dans  un

  
  

  
  

  
  

  
  

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  Fig. 3

  
  

  
  

  
  

  
  

  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  Aspect histologique d’un segment de mouvement représentatif avec des présentations horizontales et discontinues de minéralisation ectopique associée à DISH. Les images correspondent à l’échantillon représenté à la Fig. 1c,  T8-9. une  radiographie numérique du tissu intact avant la décalcification montrant la localisation

  
  

  de minéral ectopique à l’intérieur du segment de mouvement (profilé par une ligne jaune pointillée). OS VERTÉBRAL VB, disque intervertébral DIV. b  Section représentative colorée avec de l’hématoxyline et de l’éosine démontrant l’apparence de la section intacte; la barre d’échelle représente  10 mm. Jaune (c–e), blanc(f–h) etboîtes noires (i–k) correspondent à desrégions de fibrocartilage s’étendant à partir du DIV positionnées entre des excroissances minéralisées imagées avec un 4×

  
  

  objectif. c,  f,  i coloré avec de l’hématoxyline et de l’éosine; d,  g,  j coloré avec le trichrome de Masson; et  e, h, et  k les sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine visualisées avec une lumière polarisée. Les barres d’échelle pour  c–k  représentent 100 μm. c–  e Mettre en surbrillance la partie la plus antérieure de l’extensionibrocartilagineuse f (astérisque). f–h Révéler une zone de transition unique marquée par la présence de matériau granulaire amorphe (pointe de flèche noire) et de zones multifocales de fibrose (pointes de flèches blanches). i–k Afficher la région fibrocartilage (astérisque) adjacent à l’anneau fibreux natif et une région localisée d’ossification (flèche noire). Toutes les images sont orientées comme indiqué dans  un

  
  

  
  

  
  

  
  

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  Fig. 4

  
  

  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  Aspect histologique d’un segment de mouvement représentatif avec présentation verticale de la minéralisation ectopique associée à DISH. Les images correspondent à l’échantillon représenté à la Fig. 1a,  T4–5. une  radiographie numérique du tissu intact avant la décalcification montrant la localisation du minéral ectopique

  
  

  à l’intérieur du segment de mouvement (profilé par une ligne jaune pointillée). OS VERTÉBRAL VB, disque intervertébral DIV. b  Section représentative colorée avec de l’hématoxyline et de l’éosine démontrant l’apparence de la section intacte; la barre d’échelle représente 10 mm. La boîte jaune correspond à la région à l’intérieur du fibrocartilage de l’IVD avec une calcification amorphe discrète imagée avec un objectif 20× (c–e). La boîte blanche correspond à une région d’ossification hétérotopique le long de l’aspect antérieur du DIV imagé avec  un objectif de 20× (f–h). La boîte noire correspond à la calcification discrète au sein du ligament longitudinal antérieur imagé avec des objectifs 4× et 20× (i–k).  c,  f,  i Coloré avec de l’hématoxyline et de l’éosine; d,  g,  j coloré avec le trichrome de Masson; et  e, h ,  k  les sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine visualisées avec une lumière polarisée. Les barres d’échelle pour  c–k  représentent 100 μm. c–e Mettre en évidence une région amorphe de calcification dystrophique localisée au sein de l’anneau fibreux (astérisque) et caractérisée par unaspect granu lar et une colorationéosinophile variable. f–h  Région d’ossification hétérotopique marquée par des ostéons organisés (pointes de flèches noires). i–k Révéler une zone de calcification dystrophique (flèches noires) localisée dans le ligament longitudinal antérieur (contoured par des lignes pointillées noires). k  Correspond au contour pointillé dans  j. Toutes les images sont orientées comme indiqué dans  un

  
  

  
  

  
  

  
  

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  Les DIV dans les segments de mouvement intacts examinés ont démontré des caractéristiques histologiques cohérentes (n  = 12: Figs. 2–4). Bien que la hauteur radiographique du DIV ait été maintenue conformément aux critères de Resnick,2  le noyau pulpeux était granulaire en apparence, ce qui indique une dégénérescence légère à modérée. Dans toutes les sections examinées, divers degrés de dégénérescence du DIV ont été observés. Les caractéristiques de la dégénérescence comprenaient la perte d’unetransition diistinct entre le noyau pulpeux et l’anneau fibreux environnant.

  
  

  (Fig. 2b  et  4b)ainsi qu’une désorganisation modérée à sévère de la structure lamellaire de l’anneau fibreux, le plus souvent détectée le long de l’aspect antérieur de l’IVD (Fig. 3b). Les plaques d’extrémité du cartilage présentaient des irrégularités, allant de la perte d’organisation de la matrice cartilagineuse à de petites fentes et à la perturbation de l’os sous-chondral (c’est-à-dire lesnœuds de Schmorl,détectés dans des segments de mouvement 3/12 à partir de 3/6 échantillons; Figues. 2b  et  3b). Les cintres dégénératifsdétectés dans le DIV étaient attendus compte tenu de l’âge avancé des donneurs

  
  

  (intervalle de 72 à 87 ans). Le ligament longitudinal antérieur (lorsqu’il est en section) était soit bien conservé, soit contenait des régions discrètes de minéralisation (Fig. 4).

  
  

  
  

  Exploit histologiquedes structures minérales ectopiques

  
  

  Dans tous les segments de mouvement évalués, l’examen histologique a confirmé le critère de sélection radiographique d’un pont tissulaire minéralisé entre les vertèbres supérieures et inférieures à travers un DIV (Fig. 2–4). En général, les indications cellulaires d’inflammation étaient absentes des zones de minéralisation ectopique, bien quedes zones small de cellules inflammatoires dispersées (principalement des macrophages, des lymphocytes et des plasmocytes) et une néovascularisation aient été notées. Une énorme hétérogénéité a cependant été notée dans les caractéristiques histologiques des structures minérales ectopiques associées à DISH.

  
  

  
  

  Tout d’abord, les ponts minéraux ectopiques entre les segments de mouvement associés à l’aspect radiographique de la « cire de bougie fluide » de DISH variaient en longueur, en épaisseur, en volume et en type d’os (tissé vs mature). Dans les segments de mouvement caractérisés par μCT comme des présentations morphologiques verticales ou horizontales, les ponts ectopiques ont montré des caractéristiques d’os lamellaire bien développé, compatibles avec l’ossification hétérotopique (Figs. 2c–e  et  4f–h). La présence d’ostéones organisés a été confirmée par microscopie à lumière polarisée (Figs. 2e  et  4h). Dans certains segments de mouvement, ces zones d’os hétérotopiques contenaient également des espaces de moelle osseuse (Fig. 2c–e). On a souvent noté des zones focales de fibrose et d’adjacen osseux tissés primairesvers ou à l’intérieur de zones d’os hétérotopiques matures (Fig. 2f–h).

  
  

  
  

  Deuxièmement, bien que les segments de mouvement avec des minéraux ectopiques se présentant comme des extracroissances horizontales aient montrédes apparences radiograp hic similaires (Figs. 1,  2a  et  3a), la grande masse osseuseectopique n’était pas toujours continue. Au lieu de cela, des zones de fibrocartilage ont souvent été détectées dans cette région, s’étendant à partir de l’IVD et positionnées entre les excroissances minéralisées supérieures et inférieures (Fig. 3b–k). Dans ces régions de fibrocartilage se trouvaient des zones multifocales de dégénérescence granulaire, de fibrose et d’ossification. Ces sites ont montré une transition des zones de fibrocartilage aux nids  de chondrocytes dans le cartilage aux sites d’os tissés, ce qui correspond au processus d’ossification endochondrale.

  
  

  Enfin, des régions isolées de matière calcifiée amorphe ont été systématiquement identifiées dans des segments de mouvement correspondant àune ll des présentations morphologiques de la minéralisation ectopique associée à DISH (c.-à-d. discontinue-inégale, verticale et horizontale). Ces régions ont montré des caractéristiques compatibles avec la calcification dystrophique, qui se produit dans les tissus mous endommagés et estchractérisée par des dépôts amorphes de phosphate de calcium. 28,29  Des zones de calcification dystrophique ont été détectées par histologie et ont été localisées dans (i) les tissus fibrocartilagineux situés entre le DIV et les zones d’ossification hétérotopique;   ii) l’anneau fibreux (Fig. 4c–e); ou (iii) le ligament longitudinal antérieur (Fig. 4i–k). Ces zones de calcification dystrophique étaient souvent colorées de manière variable et granulaires, ce qui peut indiquer un mélange de matière calcifiée et de fibrocartilage dégénéré ou des différences dans les constituants organiques du matrix minéralisé. L’origine de ce matériau n’a pas pu être déterminée. La microscopie à lumière polarisée des régions de calcification dystrophique a montré peu de biréfringence, ce qui correspond à un manque d’organisation structurelle (Fig. 4e, k).

  
  

  
  

  Composition élémentaire et profils de diffraction des rayons X du minéral ectopique

  
  

  Étant donné que les zones de minéralisation ectopique associées à DISH contenaient des caractéristiques histologiques compatibles avec l’ossification hétérotopique et la calcification dystrophique, nous avons cherché à déterminer et à comparer la composition minérale de ces structures. First, régions d’intérêt dans quatre segments de mouvement individuels de deux épines répondant aux critères diagnostiques de DISH (Fig. 1a, f) ont été analysés parsténoscopie par specscopie aux rayonsX à dispersiond’énergiepour déterminer la composition élémentaire dans les zones d’ossification hétérotopique(n  = 5–10 régions/segment de mouvement) et de calcification dystrophique(n  = 3–8 régions/segment de mouvement). La teneur en calcium s’est avérée significativement plus élevée dans tous les sites de  minéralisation ectopique associés à DISH (ossification hétérotopique et calcification dystrophique) que dans l’os vertébral non affecté (indiqué comme os cortical) (tableau  1). Les sites de calcification dystrophique étaient associés à une plus grande teneur en phosphore par rapport à l’os vertébral non affecté et présentaient une teneur en calcium et en phosphore supérieure à celle des régions d’ossification hétérotopique. Le rapport calcium/phosphore étaitsignificativement plus élevé dans toutes les régions de minéralisation ectopique que dans les os vertébraux non affectés. D’autre part, les rapports calcium/phosphore

  
  

  étaient similaires aux sites d’ossification hétérotopique et de calcification dystrophique. Ensuite, pour établirla structure cristalline dans ces régions, les tissus ont été analysés par diffraction des rayons X. Les régions d’intérêt au sein des sites de calcification dystrophique et d’ossification hétérotopique ont montré un schéma de diffraction des rayons X correspondant à celui de  l’hydroxyapatitedéficiente en calcium [Ca8,8(PO4)6(OH)1,92, fichier dediffraction de poudre: 86-1201, Centre international de données de diffraction, 2018], tout comme les régions à l’intérieur de l’os cortical non affecté (Fig. 5). Le rapport théorique calcium/phosphore  pour l’hydroxyapatite déficiente en calcium est de 1,47, proche des valeurs trouvées par spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (tableau  1).

  
  

  
  

  Tableau 1 Teneur en calcium et en phosphore tellequ’elle est déduite par spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie

  
  

  
  

  
  

  
  

  Table pleine grandeur

  
  

  Fig. 5            

  

  
  

  
  

  
  

  
  

  Modèles de diffraction des rayons X provenant derégions de minéralisation ectopique

  avec DISH. Sont montrés des modèles représentatifs de diffraction des rayons X de l’individu

  
  

  régions à l’intérieur des sites de calcification dystrophique (n  = 2 épines; 2 régions par

  
  

  dépôt), l’ossification hétérotopique(n  = 3 épines; 2–4 régions par dépôt), et

  os cortical non affecté (3 épines; 1 région par segment) affiché dans une pile

  
  

  complot. Les résultats ont été appariés à l’hydroxyapatite déficiente en calcium

  [Ca8.8(PO4)6(OH)1.92] du Centre international de données dediffraction (poudre

  
  

  fichier de diffraction : 86–1 201), comme l’indique le diagramme à barres en bas et

  symboles

  
  

  
  

  
  

  
  

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  Analyse de la structure et de la radiodensité du minéral ectopique

  
  

  Les structures minérales ectopiques associées à DISH dans des segments de mouvement individuels ont ensuite été caractérisées par microscopie électronique à balayage et μCT (Fig. 6). Un examen des zones de calcification dystrophique par microscopie électronique à balayage a révélé des régions distinctes avec une structure uniforme et amorphe qui semblait constamment fracturée après le traitement des tissus, distincte de l’apparition d’os cortical adjacent (Fig. 6b, c). Semblable aux résultats des analyses histopathologiques, ces régions ont été localisées à l’anneau fibreux de l’IVD ainsi qu’aux structures ineuses fibrocartilagadjacentes aux ossifications hétérotopiques. Enfin, μCT a été utilisé pour générer des cartes de radiodensité pseudocolores des mêmes régions évaluées pour les caractéristiques physiques. Cette analyse a démontré une variation remarquable de la radiodensité desstructures ralisées par les mines (Fig. 6). Dans les segments de mouvement examinés, des foyers de tissus minéralisés correspondant à des régions de calcification dystrophique ont été détectés, avec des radiodensités supérieures  à celles correspondant aux régions d’ossification hétérotopique et à l’os vertébral non affecté. La présence de ces régions de radiodensité élevée est compatible avec la plus grande teneur en calcium et en phosphore que l’on trouve dans les calcifications dystrophiques using spectroscopie de rayons X à dispersion d’énergie.

  
  

  
  

  Fig. 6

                                 

  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  Caractérisation de la morphologie brute et des radiodensités des minéralisations ectopiques associées à DISH. a–aʹʹ  Segment thoracique T9-10 d’un mâle de 85 ans atteint d’ossification hétérotopique (Fig. 1a),  b–bʹʹ segment thoracique T3-4 d’un mâle de 72 ans présentant une calcification dystrophique (Fig. 1f), et  c–cʹʹ segment thoracique T3-4 d’un mâle de 85 ans atteint de calcification dystrophique (Fig. 1a).  a–c L’aspect  brut des tissus desséchés avec des lignes pointillées jaunes montrant des régions analysées par microscopie électronique à balayage;  les barres d’échelle blanche représentent 10 mm. aʹ– cʹ  Images correspondantes de microscopie électronique à balayage; les barres d’échelle jaune représentent 1 mm. aʹʹ–

  
  

  cʹʹ Cartes de radiodensité pseudocolores à partir de tranches μCT appariées. Les couleurs  représentent diverses radiodensités : le violet (−232 à 310  unités de Hounsfield) correspond aux tissus mous ; le bleu-vert (310–2 750 unités de Hounsfield) correspond à l’os normal ; et l’orange-rouge (2 750–3 253 unités de Hounsfield) correspond aux minéralisations dépassant la densité de l’os cortical normal. Analyse topographique decoupes de tissus par microscopie électronique à balayage

  
  

  a mis en évidence l’aspect uniforme et amorphe des calcifications dystrophiques (pointes de flèches noires) à l’intérieur du disque intervertébral, qui sont distinctes en apparence desossifications adjacentes (pointe de flèche blanche); les barres d’échelle blanches représentent 10 mm. Toutes les images sont orientées comme indiqué dans  un

  
  

  
  

  
  

  
  

  Image en taille réelle

  
  

  Après avoir identifié les régions hyperdenses (avec des radiodensitéset des décélérations de l’os cortical normal) comme une caractéristique de la calcification dystrophique, nous l’avons utilisée comme critère pour évaluer la présence de calcification dystrophique dans les épines non diagnostiquées avec DISH et leur association avec la minéralisation reliant le DIV. En utilisant μCT, nous avons d’abord évalué la présence ou l’absence de foyers minéralisés hyperdenses dans l’anneau fibreux ou le ligament longitudinal antérieur dans 77 segments de mouvement d’épines qui ne répondaient pas aux critères diagnostiques de DISH et 94 segments de mouvement d’épines avec DISH (tableau  2). Une colonne vertébrale présentant un pontage avancé associé à une spondylarthrite ankylosante a été exclue de l’analyse pour réduire les faux positifs. Nous avons  montré que dans les épines qui ne répondent pas aux critères diagnostiques de dish, 38 des 77 segments de mouvement (49%) présentaient des foyers hyperdense dans le DIV, contre 72 des 94 segments de mouvement (77%) dans les épines avec DISH. Bien que les calcifications dystrophiques ne soient pas unecaractéristique unique associée à DISH, elles sont plus fréquentes dans les segments de mouvement des épines diagnostiquées avec DISH que dans celles des épines non diagnostiquées avec DISH (P  = 0,000 4). Nous avons également examiné si la présence de ces foyers hyperdense était associée àla présence de minéralisation reliant l’IVD (ossification hétérotopique). Dans les épines qui ne répondaient pas aux critères diagnostiques de l’DISH, 12 des 38 segments de mouvement avec des foyers hyperdense (32%) présentaient également une minéralisation reliant le DIV; en revanche, dans les épines avecDISH, 58 des 72 segments de mouvement avec des foyers hyperdense (80%) avaient également une minéralisation reliant l’IVD. L’analyse statistique a démontré que la présence de foyers hyperdense était associée à une minéralisation reliant le DIV dans les deux groupes.

  
  

  
  

  Tableau 2 Prévalence des foyers minéralisés hyperdense dans tous les segments de mouvement avec ou sans pont minéral ectopique de l’IDIV déterminée par μCT, dans les épines qui répondent ou ne répondent pas aux critères diagnostiques de DISH

  
  

  
  

  
  

  
  

  Table pleine grandeur

  
  

  Cette analyse est limitée de manière importante par les critères diagnostiques de DISH utilisés pour catégoriser les échantillons. Plus précisément, le diagnostic de DISH nécessite quatre segments de mouvement continus avec des preuves radiographiques de minéralisation de pontage, un seuil que l’on pense être associé à un stade avancé de la maladie. En fait, certaines des épines qui ne répondaient pas aux critères diagnostiques de DISH ont montré une minéralisation ectopique reliant plus d’un but moins de quatre segments de mouvement. Pour éliminer la variabilité potentielle associée au stade de DISH, nous avons analysé l’association entre la présence de foyers hyperdense et la minéralisation reliant le DIV dans tous les segments de mouvement, indépendamment de la classificationen tant que DISH (Tableau  3). Sur les 171 segments de mouvement évalués, 110 présentaient des foyers hyperdenses dans le DIV. Parmi ceux-ci, 70 (64%) avaient une minéralisation reliant l’IDIV, démontrant ainsiune forte association entre ces deux caractéristiques (P  < 0,000 1).

  
  

  
  

  Tableau 3 Prévalence des foyers minéralisés hyperdense dans tous les segments de mouvement avec et sans pont minéral ectopique de l’IVD tel que déterminé par μCT

  
  

  
  

  
  

  
  

  Table pleine grandeur

  
  

  Discussion

  
  

  
  

  
  

  
  

  Les caractéristiques de la formation minérale ectopique qui définissent le DISH ont été principalement caractérisées par l’imagerie clinique, avec peu de rapports antérieursprésentant une caractérisation détaillée des changements spécifiques aux tissus dans les segments de mouvement de la colonne vertébrale. La présente étude a comblé cette lacune en caractérisant les caractéristiques pathologiques des structures minérales ectopiques associées à dish dans les problèmes cadavériques humains enutilisant une combinaison d’approches radiologiques, histologiques et physiques. Nos résultats sont les premiers à établir que la minéralisation ectopique dans DISH résulte à la fois de l’ossification hétérotopique et de la calcification dystrophique des tissus rachidiens, y comprisle DIV et le ligament longitudinal antérieur. Sur la base de ces études et d’études antérieures de notre groupe,27,  nous postulons que les deux formes de minéralisation ectopique peuvent refléter desprocessus pathologiques différents ou peut-être des stades distincts de la pathogenèse de DISH.

  
  

  La caractéristique radiographique classique de DISH est la présence d’une minéralisation fluide le long de l’aspect antérolatéral de la colonne vertébrale,1 mais notre rapport précédent a identifié une hétérogénéité dans l’apparence morphologique du minéral ectopique associé à DISH sur la base d’une analyse μCT. 27 Cette  hétérogénéité était également évidente dans l’apparition histologique de segments de mouvement individuels à partir d’épines avec DISH basée sur la variabilité notée dans la structure, l’organumisation et les caractéristiques des ponts minéralisés le long de l’aspect antérieur de la colonne vertébrale. Par exemple, malgré la démonstration d’un aspect radiographique similaire, une variabilité a été détectée dans les caractéristiques de l’os lamellaire mature (avec ou sans moelle osseuse) et desindicateurs de l’ossification endochondrale. Il est important de se rendre au point que notre étude a également identifié des régions discrètes de matériau amorphe et acellulaire calcifié dans les lamelles externes de l’anneau fibreux, du ligament longitudinal antérieur et de l’extension fibrocartilairedu DIV adjacente aux ponts osseux antérolatérés. Ces régions présentaient des caractéristiques histologiques compatibles avec la calcification dystrophique et ont été détectées quelle que soit la classification morphologique de la structure minérale ectopique (c.-à-d. présentationsdiscontinuo-inégales, verticales et horizontales). Les régions de calcification dystrophique étaient histologiquement distinctes des zones d’ossification hétérotopique et présentaient des différences dans la teneur en calcium et en phosphore; d’autre part, les deux ont montré des modèles de diffraction des rayons X correspondant à ceux de l’hydroxyapatite déficiente en calcium. Par conséquent, dish peut non seulement être une pathologie de la formation osseuse (ossification hétérotopique), mais peut également inclure des caractéristiques de calcification dystrophique. Notamment, l’analyse μCT des zones  de calcification dystrophique a démontré des radiodensités supérieures à celles de l’os vertébral non affecté et dans les zones d’ossification hétérotopique. Ces foyers hyperdenses de calcifications dystrophiques étaient présents dans les trois présentations morphologiques décritesde lamaladie et étaient associés à la présence d’une minéralisation ectopique reliant le DIV. Bien qu’il soit tentant de supposer que ces caractéristiques histopathologiques distinctes de la calcification dystrophique peuvent refléter différents stades dela maladie,d’autres études sont nécessaires pour évaluer leur relation avec le schéma spatio-temporel de la progression de la maladie.

  
  

  
  

  L’exclusion d’autres pathologies de la colonne vertébrale, telles que la spondylose (c.-à-d. dégénérescence DIV) et l’ankylosation est importante pour le diagnostic de DISH.

  
  

  Ankylosante. 2  Plus précisément, contrairement à la spondylose, la hauteur du DIV est préservée et les ostéophytes sont verticaux et pontants dans la DISH, alors que dans la spondylose,  ils sont généralement transversaux, sur la base d’une évaluation radiographique. 30  Une étude pilote menée avec des tissus rachidiens de dix cadavres avec DISH a établi que le degré dedégénérescence hist opathologique de la DIV et les mesures de la taille du disque étaient comparables entre les échantillons appariés selon l’âge et le sexe sans DISH, suggérant un rôle limité de la dégénérescence du DIV dans la pathogenèse du DISH. 25  L’évaluation histopathologique de la présente étude a mis en lumière une dégénérescence légère à modérée du DIV dans tous les échantillons examinés, ce qui peut avoir été insuffisant pour affecter la hauteur du disque radiographique. Notez que la perte de IVD height empêcherait le diagnostic de DISH sur la base de critères radiographiques. 2  Ces résultats sont conformes à des études antérieures démontrant des changements dégénératifs dans les DIV des personnes atteintes de DISH. 31,32 Dans l’ensemble, la dégénérescence DIV légère à modérée doit être considéréecomme un scénario cliniqued’accompagnement dans la formation de minéraux ectopiques dans dish, car elle est fréquente dans cette population.

  
  

  
  

  Malgré la préservation radiographique de la hauteur de l’IDIV (avec ou sans légère à-

  dégénérescence modérée), les démonsde l’étude actuelle ont noté que morphologique

  
  

  les modifications de l’anneau fibreux externe sont fréquentes dans dish. Nos conclusions concordent

  
  

  avec celles d’études antérieures qui ont identifié le fibrocartilage s’étendant à partir de la

  DIV entre les ponts osseux antérolatérals associés aux deux supérieurs

  
  

  et vertèbres inférieures, adjacentes à la longitudinale antérieure

  
  

  ligament. 25,33  En fait, Kuperus et al. ont proposé un système de notation pour caractériser

  la forme morphologique brute de ces extensions fibrocartilagineuses de la

  
  

  DIV (définie comme régulière, effilée, spatulée ou irrégulière29, dont plusieurs

  ont été notés dans la présente enquête). Dans notre étude, histopathologique

  
  

  l’évaluation de ces régions fibrocartilagineuses a révélé des caractéristiques de

  
  

  endochondral ossification, y compris les nids de chondrocytes et de tissus primaires

  
  

  os, ainsi que des zones distinctes de calcification dystrophique.

  
  

  
  

  Nous théorisons que la calcification dystrophique peut être le résultat de changements cellulaires ou d’une nécrose des cellules fibrocartilaires résidentes enréponse à un traumatisme, à une dégénérescence ou à l’âge. À cet égard, les lésions des tissus mous, tels que les tissus cardiovasculaires et conjonctifs, y compris les tendons, peuvent entraîner une production locale d’aberrants ou

  
  

  démasquage des molécules qui servent de substrats pour nucléer la formation initiale de cristaux de phosphate de calcium dans la matrice extracellulaire, conduisant à une calcification dystrophique. 34,35  Il est possible que les calcifications dystrophiques dans les structures des tissus mous de la colonne vertébrale (c’est-à-dire l’anneau fibreux et le ligament longitudinal antérieur) jouent un rôle dans la pathogenèse de DISH. Il existe desmécanismes potentiels par lesquels la calcification dystrophique pourrait conduire à une ossification hétérotopique. Par exemple, on sait que le phosphate de calcium lui-même dans les tissus mous peut induire une ossification,36,37,38 compte tenu du présen ce des cellules précurseurs appropriéeset des conditionsmicroenvironnementales. Ainsi, la calcification dystrophique pourrait conduire directement à une ossification hétérotopique dans les tissus rachidiens. Il est possible qu’à l’intérieur des ligaments de la colonne vertébrale et de la périphérie du DIV, les bonnes conditionsexistent pour permettre l’ossification. En revanche, dans les lamelles plus profondes de l’anneau fibreux, les calcifications dystrophiques pourraient persister sans passer à l’ossification hétérotopique en raison de l’absence de précurseurs ostéogéniques appropriés ou d’unmicroenvironnement onductif ostéooc. Un deuxième mécanisme potentiel est que la calcification dystrophique dans le fibrocartilage rachidien entraîne une altération de la biomécanique tissulaire. Une raideur tissulaire accrue, due à la présence d’une calcification dystrophique, peut induire la formationd’ostéophytes. À cet égard, d’autres ont proposé qu’une contrainte mécanique accrue sur les vertèbres puisse conduire à la formation d’ostéophytes. 39  Il est concevable que ces osteophytes puissent alors conduire à un pont entre l’ossification des ligaments spinaux et de la périphérie du DIV. Cette possibilité est conforme aux études précédentes proposant que dish est associé à la formation dégénérative d’ostéophytes, similaire à celle qui se produit dans les spondyloses et l’arthrose. 4  Pour résoudre le mécanisme, nous avons besoin d’études supplémentaires des tissus mous de la colonne vertébrale aux premiers stades de la minéralisation ectopique.

  
  

  
  

  Il y ades rapports mitigés concernant l’implication du ligament longitudinal antérieur dans la pathogenèse de DISH. Certaines études ont rapporté une minéralisation du ligament longitudinal antérieur dans DISH,21,24,40  tandis que d’autres rapportent que la ligament longitudinale antérieure ne subit pas deminéralisation1,21 ou qu’elle est déplacée par la formation de structures minérales ectopiques. 26  Dans la présente étude, lorsqu’elle était présente dans les sections histologiques examinées, la structure du ligament longitudinal antérieur était généralement préservéed. Cependant, dans un sous-ensemble de spécimens, nous avons détecté des régions focales de

  
  

  calcification dystrophique dans le ligament, ressemblant à celles détectées dans l’anneau fibreux. D’autres études sont nécessaires pour examiner spécifiquement l’association spatio-temporelle entre la calcification du DIV et la calcification du ligament longitudinal antérieur dans le contexte de la progression et de la gravité de la DISH.

  
  

  
  

  Les résultats de la présente étude établissent que les critères radiographiques actuels pour DISH capturent des caractéristiques hétérogènes associées à la fois à la calcification dystrophique et à l’ossification hétérotopique des tissus fibrocartilagineux de la colonne vertébrale. Dans l’ensemble, la présente étude en déduit que la pathogenèse DISH invol oles deux types distincts de minéralisation ectopique en fonction (i) de l’aspect morphologique du minéral; ii) leur teneur en calcium et en phosphore; iii) leur radiodensité; et iv) les tissus touchés. Semblable à la tendinite calcifique, la détectiondes zones focales de la calcification dystrophique dans les tissus fibrocartilagineux de la colonne vertébrale peut servir d’indication radiographique de DISH à un stade précoce. Des travaux futurs sont nécessaires pour valider l’association de ces caractéristiques radiographiques et histologiques dans unecohorte d’échantillons, pour corréler les caractéristiques histologiques avec les symptômes et/ou les comorbidités de la maladie, pour identifier des biomarqueurs permettant de différencier ces présentations dans les études cliniques et pour associer les symptômes cliniques et les caractéristiquesde la maladie à laprogression de la maladie.

  
  

  Matériaux et méthodes

  
  

  
  

  
  

  
  

  Cette étude a été menée avec des épines cadavériques humaines embaumées intactes

  
  

  (n  = 19: 6 femmes et 13 hommes, âge médian 85 ans, fourchette 65-94) de la Schulich School of Medicine & Dentistry de l’Université de Ouest de l’Ontario conformément à la Loi sur l’anatomie de l’Ontario et aux lignes directrices du Comité pour l’utilisation cadavérique dans la recherche de Western (CER#10292018). Le processus d’embaumement consistait en une distribution artérielle du liquide d’embaumement, contenant un mélange d’éthanol, de  phénol et de forma formel (Wessels & Associates: Troy, MI, États-Unis), 24 à 48 heures après l’autopsie. L’ablation de la musculature de la tête et du cou a exposé les premières vertèbres cervicales, et une résection complète a été effectuée inférieure au douzième corps vertébral thoracique. Les  côtes ont été disséquées latéralement de 3 à 5 cm aux articulations costovertébrales, et les tissus mous associés à la colonne vertébrale ont été préservés à l’exception de l’aorte thoracique descendante, qui a été enlevée.

  Imagerie par micro-tomodensitométrie (μCT)

  
  

  Descolonnes ertebrales humaines intactes ont déjà été scannées par μCT comme

  
  

  décrit27  à l’aide d’un système d’imagerie à rayons X à faisceau conique (GE Locus eXplore Ultra: London, CAN) à une tension de crête de 80 kVp et un courant de tube de 50 mA. Les 1 000 projections de rayons X ont été reconstruites en un seul volume tridimensionnel avec un espacement isotrope du voxel de 154 μm. Les volumes d’images ont été redimensionnés en unités Hounsfield à l’aide d’un calibrateur interne d’air et d’eau et d’unsubstitut osseux cortical (450-SB3, Gammex RMI: Middleton, WI, USA). Les données μCT ont été utilisées pour générer une série d’images pour chaque échantillon qui ont été précédemment évaluées par deux observateurs cliniciens afin de diagnostiquer DISH en utilisant les critères radiographiques de Resnick et Niwayama. 2  Des rendus isosurface tridimensionnels et des images μCT pseudocolores ont été exportés à partir de MicroView (version 2.2, GE Healthcare : Londres, CAN ; et version 2.5.0, Parallax  Innovations Inc. : Ilderton, CAN). Les données de μCT ont été regroupées dans des tableaux de contingence et évaluées parle test exact de Fisher bilatéral (α  = 0,05).

  
  

  
  

  Évaluation histologique

  
  

  Six épines thoraciques répondant aux critères diagnostiques de la DISH (une femme et cinq hommes; âge médian de 82 ans, intervalle de 72 à 87 ans) ont été disséquées en segments de mouvement individuels par des coupes transversales à la taille des vertèbres supérieures et inférieures pour maintenir le DIV et par des coupes obliques pour éliminer les caractéristiques osseuses postérieures du corps vertébral (Fig. supplémentaire. S1a). Plusieurs segments de mouvement de chaque spécimen ont été sélectionnésd pour des analyses basées sur la présence de présentations distinctes de minéralisation ectopique précédemment décrites par notre groupe (c.-à-d. discontinues-inégales, verticales et horizontales). 27  Au total, 15 segments de mouvement ont été analysés.

  
  

  
  

  Pour isoler les tissus d’intérêt des segments de mouvement intacts, une tranche sagittale a été réalisée à travers le centre de la minéralisation ectopique associée à chaque segment de mouvement à l’aide d’une scie à lame diamantée rotative (Fig. supplémentaire S1b). En cas de droite, des coupes obliques ont été effectuées à travers le centre de la minéralisation ectopique (Fig. supplémentaire. S1c). À partir de l’une de ces moitiés, une tranche de tissu de 1 mm d’épaisseur a été disséquée pour une analyse ultérieure de la composition tissulaire. Chaque moitié des segments de mouvement isolés et les tranches de 1 mm d’épaisseur ont été imagées à l’aide d’un système de radiographie numérique (Planmeca).

  
  

  ProX™: Helsinki, FIN) pour localiser les zones de minéraux ectopiques. Sur la base des radiographies numériques, la moitié a été sélectionnée pour l’analyse histologique et décalcifiée avec Shandon™ TBD-2™ (n° de catalogue 6764004, Thermo Scientific™: Nepean, CAN) pour une durée de 14 à 21 jours. Après décalcification, les tissus ont été traités et sectionnés à 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome Leica RM2255 (Leica Biosystems Nußloch GmbH: Nußloch, DEU) et collectés sur des lames de 50 × 75 mm (Brain Research Laboratories: Newton, MA, USA). Les coupes en série ont été colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour localiser les cellules et évaluer la structure de la matrice extracellulaire, et le trichrome de Masson pour détecter la composante collagène de la matrice extracellulaire. Les micrographies à faible grossissement  ont été capturées à l’aide d’un lecteur multimode d™'imagerie à 5 cellules (BioTek Instruments, Inc. : Winooski, VT, États-Unis) et des micrographies à fort grossissement (y compris celles sous lumière polarisée linéaire) ont été capturées à l’aide d’un microscope optique Olympus BX41 équipé d’unappareil photo numérique(Olympus U-TVO.5XC-3, Olympus Canada Inc. : Toronto, CAN) et du logiciel Infinity Analyze (version 6.5.5, Lumenera Co. :  Ottawa, CAN). Les images ont été importées dans Adobe® Photoshop® CC 2018 (version 19.1.7, Adobe Systems Inc. : San Jose, C A,États-Unis) pour la construction de figurines.

  
  

  
  

  Microscopie électronique à balayage, spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie et diffraction des rayons X

  
  

  Les tranches de tissu de 1 mm d’épaisseur prélevées au centre de la minéralisation ectopique ont été desséchées avec de la drierite (W.A. Hammond Drierite Co.: Xenia, OH, USA) pendant 30 jours, photographiées avec un appareil photo reflex numérique canon EOS 7D à objectif unique, rincées à 100% de chloroforme pendant 1 h, puis redessinées pendant 1 à 2 jours avant d’être recouvertes d’une couche d’osmium de 10 nm. 41 La  microscopie électronique à balayage a été réalisée à l’aide d’un instrument Zeiss 1540XB FIB/SEM (Carl Zeiss : Oberkochen, DEU) à l’installation de nanofabrication de l’Université Western Ontario. Les données de spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie ont été recueillies à l’aide d’un système d’analyse X-max50 d’Oxford Instruments et du logiciel ICNA (Oxford Instruments : Abingdon, Royaume-Uni). Plusieurs régions d’intérêt dans chaque zone de minéral ectopique (10 à 16 régions par gisement) ont été analysées, ainsi quedes régions d’intérêt dans l’os cortical non affecté dans les mêmes spécimens (par exemple, l’aspect postérieur des vertèbres). Les résultats élémentaires ont été exprimés en pourcentages atomiques. Les données ont été importées dans GraphPad Prism

  
  

  (Version 6.01: San Diego, CA, USA) pour l’analyse statistique. Les données ont été évaluées pour la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk et pour les valeurs aberrantes à l’aide du test bilatéral de Grubbs (α  = 0,05: un résultat de l’os cortical a été identifié). Les données ont ensuite été évaluées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle (α  = 0,05) avec le test de comparaisons multiples de Bonferroni.

  
  

  
  

  Les mêmes tissus ont été évalués pour les modèles de diffraction des rayons X à l’aide d’un diffractomètre Bruker D8 Discover (Bruker Co.: Billerica, MA, Usa) et d’un système de diffraction du détecteur de zone générale Bruker AXS (Bruker AXS GmbH: Karlsruhe, DEU) au Département des sciences de la Terre de l’Université Western Ontario. 42  Le diamètre nominal du faisceau pour chaque mesure était de 300 μm. Les régions d’intérêtdans les zones desminéraux ectopiques (5 à 7 régions par dépôt) et des os corticaux non affectés (1 à 2 régions) ont été sélectionnées pour chaque segment de mouvement à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra à dispositif à couplage de charge. Les données ont été analysées avec le logiciel DiffracPlus™ EVA de Bruker (Bruker Co.: Billerica, MA, USA) pour comparaison avec les fichiers de diffraction de poudre de la base de données international Centre for Diffraction Data® (Newton Square, PA, USA) comme détaillé dans un protocole précédent. 42

  
  

  
  

  
  

  
  

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